KpnI和NcoI 进行双酶切的时候，buffer（Takara公司）怎么加？

• 我想问一下从PCR开始有带胶回收双酶切，载体双酶切，胶回收后怎么把载体和酶切后的基因连在一起
• Xho1和Nde1 50μl双酶切反应体系的配制？？
• SacI 和BamHI 双酶切 用什么buffer
• Ecor1 和 Nco1双酶切体系的配制

我想问一下从PCR开始有带胶回收双酶切，载体双酶切，胶回收后怎么把载体和酶切后的基因连在一起

我们用天根公司的胶回收试剂盒，回收目的基因及载体双酶切后的产物用于连接，连接体系如下：一般载体1微升，目的基因8微升左右（没.测OD）,用T4DNA连接酶（购于TaKaRa公司）1微升，再加酶缓冲液（2.5微升）和水至总体积25微升，16度过夜后第二天转化感受态细菌。目的基因与载体的摩尔数比一般为3至10比1

Xho1和Nde1 50μl双酶切反应体系的配制？？

由这两种酶组成的双酶切体系并不需要添加BSA，请你仔细核对，两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度。如果选用TaKaRa的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer，对于50 μl的酶切体系而言应分别加入1.5 μl的Xho1和Nde1并且加入5 μl的10×H Buffer（使得酶切体系中的Buffer浓度为1×工作浓度），最后加入适量的质粒分子并双蒸水补足反应体积至50 μl。

SacI 和BamHI 双酶切 用什么buffer

不同公司的酶和buffer命名和特性是不完全一样的。像takara公司的内切酶有一个双酶切的列表，列出了每两种酶双酶切最适用的buffer。

像NEB公司的话，酶4种buffer中的活性都列出来了，选一个两种酶活性都高的就可以了。

其他公司的产品也一样，主要是认真阅读说明书和产品资料。祝你好运。

Ecor1 和 Nco1双酶切体系的配制

你用的是哪个公司的酶？ 不同公司的buffer不一样的。

不过，对于一般的体系，可以选择10微升体系或20微升体系。具体是1/10体积的buffer，酶的总体积控制在1/10以内，比如10微升体系酶量不要超过1微升，20微升体系不要超过2微升。DNA加入1~1.5微克即可。用水补足体积。