KpnI和NcoI 进行双酶切时，buffer（Takara公司）怎么加？ 40μL体系，就是不知道10X K Buffer这么用？

• 20ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别
• Xho1和Nde1 50l双酶切质粒加多少
• 双酶切的20μL反应体系和反应时间如何确定？最好是说明原理。所用的酶都是Takara公司的
• takara双酶切反应体系

20ul双酶切体系和10ul双酶切体系的区别

1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热90秒钟后，再在冰中放置2分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功，可做如下对照： A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时，也要进行对照. 设4个： A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误. D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒，图省事最后却更费事.注意设立对照。 经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。

Xho1和Nde1 50l双酶切质粒加多少

由这两种酶组成的双酶切体系并不需要添加BSA，请你仔细核对，两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度。

如果选用TaKaRa的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer，对于50 μl的酶切体系而言应分别加入1.5 μl的Xho1和Nde1并且。

双酶切的20μL反应体系和反应时间如何确定？最好是说明原理。所用的酶都是Takara公司的

模板DNA 几百ng-几ug，区别不大

酶1 0.5ul

酶2 0.5ul

buffer 去Takara产品目录查双酶切buffer表，按照那个倍数加，有时候需要BSA

水补足 20ul

30或37度，1-5小时都可以。有个别酶需要55度。

注意，酶别加多了，甘油浓度过高影响酶的活性。反应体系中甘油浓度要小于1%，而酶是储存在50%甘油中。

takara双酶切反应体系

1、如果你用的是Takara的酶,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧.

2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切（好像是,你需要自己再确认下）,而且NEB的这两种酶都有HF酶,效率更高,都可以在buffer4中达到100%的效率.

以上,仅供参考~