对于核酸检测整个过程有什么样的感受,整个过程有什么优缺点? goldview核酸染料
测定核酸含量的方法有哪些,各种方法的优缺点是什么?
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目前常用2种:
1. 荧光染色。很灵敏,但是需要标准品,还要染色
2。 UV。直接测量,方便。但是易受蛋白污染的影响,敏感度不高。
紫外可见分光光度计法测核酸含量有何优缺点
方便,灵敏,除了知道含量,还知道组成成分。
从吸收光谱中,可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较,或通过确定最大吸收波长,或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度,并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
扩展资料:
物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下,物质的吸收系数是恒定的,且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其吸光度。
即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区,除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称之为比色分析。
参考资料来源:百度百科-紫外-可见分光光度法
用紫外吸收法测核酸含量有何优缺点
用紫外光吸收法测定样品的核酸含量,具有简单、快速、灵敏度高的优点,并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质,产生较小测定误差。 但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时,则会产生较大测定误差,需要设法事先除去。
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用紫外分光光度法测定核酸的缺点有哪些
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(-C=C一C=C 一),能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光.核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处.遵照Lambert-Beer 定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量.
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收光也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数也随之不同.所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行.
核酸的摩尔消光系数(或吸收系数),通常以ε(ρ)来表示,即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值(即光密度,或称为光吸收).核酸的摩尔消光系数不是一个常数,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化.它们的经典数值(pH = 7.0)如下:
DNA 的ε(ρ)= 6 000 8 000
RNA 的ε(ρ)= 7 000 10 000
小牛胸腺DNA 钠盐溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 6 600,DNA 的含磷量为9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐的溶液光密度为0.020.RNA 溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 7 700~7 800,RNA 的含磷量为9.5%,含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022~0.024.采用紫外分光光度法测定核酸含量时,通常规定:在260nm 波长下,浓度为1μg/mL 的 DNA 溶液其光密度为0.020,而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024.因此,测定未知浓度的DNA (RNA)溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量.该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg/mL 的含量即可测出.对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定误差较小,若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质,测定误差较大,应设法事先除去.
由于降解或水解作用,核酸的光密度可以增高约40%,这就是众所周知的增色效应(hyperchromic effect).在大分子的核酸中,氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为.因此,核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度,该现象称为减色效应(hypochromic effect).